多光子顕微鏡とは

多光子顕微鏡はレーザー走査型顕微鏡の一種です。赤外領域のパルスレーザーによる多光子励起を行い、サンプルからの蛍光強度を観測します。サンプルまたはレーザーをスキャンして、三次元イメージングをすることができるシステムです。

本記事では、多光子顕微鏡の原理や用途、また構成の要となる光源について解説します。

多光子顕微鏡の原理と特徴

多光子顕微鏡は、多光子励起による *1蛍光 現象を利用した顕微鏡です。

蛍光現象とは

*2蛍光分子 に励起光を照射すると蛍光分子が励起され、*3励起状態 から *4基底状態 に戻る過程で特定波長の光を放出します。この一連の現象を 蛍光現象と呼び、放出される光の波長に対する強度分布は *5蛍光スペクトル と呼ばれます。

下記の図1は、励起光、*6吸収スペクトル、蛍光スペクトルの関係を表したものです。蛍光分子に吸収スペクトルに含まれる波長の光を照射すると、1つの蛍光分子は1光子を吸収し、1光子の蛍光を放出します。この励起光1光子で引き起こされる励起を1光子励起と呼びます。

図1　励起光と蛍光スペクトルの関係

多光子励起とは

吸収スペクトルと一致しない光を照射すると、通常は光の吸収すなわち励起は起きませんが、光のパワーを強くすると多光子励起と呼ばれる現象がおこります。

下記の図2は、2光子励起の励起光、吸収スペクトル、蛍光スペクトルの関係を表した図です。蛍光分子は1光子励起と比較すると波長が2倍、つまりエネルギーが1/2倍の励起光2光子を吸収し、1光子の蛍光を放出します。

図2　多光子励起の励起光と蛍光スペクトルの関係

励起光が2光子の場合を2光子励起、3光子の場合を3光子励起と呼び、これらをまとめて多光子励起と呼びます。これら多光子励起を意図的に引き起こすには、高い光子密度が必要です。そのため、超短パルスという特徴を持つレーザーが利用されます。

多光子顕微鏡の特徴

多光子励起を利用した顕微鏡を、多光子顕微鏡といいます。多光子顕微鏡は、集光された点のみで蛍光が発生することを利用して、高い分解能での三次元計測を可能にしています。

下記の図3は、１光子励起と多光子励起の蛍光現象が起こる範囲を比較した図です。
励起光が対物レンズを通過し、サンプル内で集光される様子を表しています。この際、1光子励起の場合は、光が通過する全領域で蛍光現象が発生する可能性があります。一方、多光子励起の場合は、対物レンズによって集光されていない領域は光強度が低いため蛍光現象が発生しませんが、集光された点では光強度が高くなり多光子励起による蛍光現象がおこります。

多光子顕微鏡はサンプル内部のどの位置でどれだけの強度の蛍光を計測したかを記録することで、イメージングを行っています。多光子顕微鏡の蛍光現象は、対物レンズで集光した焦点スポットのみで引き起こされるため、サンプルから生じた蛍光は焦点位置で発生した光だと考えることができます。つまり、１光子励起より高い分解能が実現可能で、さらに、焦点スポット以外でのパワーロスが少ないため、より深い位置まで計測が可能になっています。

図3　1光子励起と多光子励起の焦点付近の蛍光が起こる範囲を比較した図

多光子顕微鏡の基本的な構成

下記図4は、顕微鏡の基本的な構成図です。
光源から射出された光はダイクロックミラーで反射された後、対物レンズを通りサンプル内で集光されます。焦点スポットで蛍光現象が引き起こされて放出された蛍光はダイクロックミラーを透過し検出器に入射します。ダイクロックミラーは特定の波長の光を反射し、残りの波長を透過するという特徴を持つ光学素子で、多光子顕微鏡においては励起光と蛍光を分離する役割を持ちます。

図4　顕微鏡の基本構成

三次元的にスキャンしイメージングを行う際には、ガルバノスキャナと呼ばれるレーザーを走査するシステムと、対物レンズもしくはサンプルステージを奥行方向に移動するシステムがよく用いられます。計測位置を制御しながら蛍光の計測をすることで、三次元イメージングを行います。

多光子顕微鏡に使用される光源

多光子励起を引き起こすためには、高い光子密度が必要であり、超短パルスレーザーが使用されます。

チタンサファイアレーザー

多光子顕微鏡用のパルスレーザーとして、*7固体レーザー の一種であるチタンサファイアレーザーが用いられることが多いです。波長帯域は広帯域で平均出力も高いことが特徴です。しかし、装置本体が大型、高額、メンテナンスコスト大などの要因により導入が容易ではありません。

ファイバレーザー

チタンサファイアレーザーと比べると狭帯域、低パルスエネルギーですが、小型で安価、取り扱いが簡単で、比較的簡単に導入できるのが特徴です。

製品例：超短パルスファイバレーザー『iQoM』
大型・高額なチタンサファイアレーザーと比較し『iQoM』は、低価格かつ小型で、チタンサファイアレーザーの約10分の1以下のコスト、サイズも50分の1以下で非常に安定性に優れた超短パルスレーザーです。

▼ 多光子顕微鏡原理紹介/ファイバレーザー応用│Vol.94

多光子顕微鏡の用途・応用事例

医療分野

多光子顕微鏡の特徴として、高い分解能での三次元計測が可能であること、生体組織の透過性に優れた近赤外光が用いられていること、光強度が高い場所が局所的で光損傷が抑えられることが挙げられます。 　
これらの特徴を活かして、他の顕微鏡では観察が困難な、生きた動物生体内の脳、神経細胞活動、血流等の観察等に用いられています。

▼ 未来医療「オプトジェネティクス」にフェムト秒レーザーが活躍する?!│Vol.54

工業分野

非破壊・非侵襲でイメージングできるという特徴を活かして、半導体基板等の欠陥検査への応用が期待されています。

▼ 日本の半導体産業を『iQoM』が支える！？Vol.43

まとめ

• ・多光子顕微鏡とは、多光子励起による蛍光現象を利用した顕微鏡のことです。
• ・多光子顕微鏡は高い空間分解能での三次元計測が可能です。
• ・多光子顕微鏡には、超短パルスレーザーと呼ばれる光源が使用されます。
• ・多光子顕微鏡は医療分野や産業分野での応用が期待されています。

用語集

用語	意味
*1 蛍光	原子(分子)中の電子が励起状態から基底状態に遷移するときに自然放出される光のこと。
*2 蛍光分子	光を吸収して効率よく蛍光を放出する分子のこと。特定の波長の光エネルギーを吸収した後、このエネルギーを特定の波長の光として放出する。
*3 励起状態	原子(分子)中の電子のエネルギーが高い状態のこと。
*4 基底状態	原子(分子)中の電子のエネルギーが低く安定な状態のこと。
*5 蛍光スペクトル	蛍光分子が励起光を吸収した後に放出する蛍光のスペクトル分布のこと。
*6 吸収スペクトル	蛍光分子が吸収できる光のスペクトル分布のこと。
*7 固体レーザー	レーザー媒質としてイオン添加結晶等が用いられたレーザーのこと。